由圖可見,轉(zhuǎn)基因載體P2、P4與pEGFP-N1質(zhì)粒的復(fù)合物在U-2OS細(xì)胞中有血清條件都有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá),與市售的bPEI 25kDa相比,都表現(xiàn)出了比PEI更高的轉(zhuǎn)染效率。 [0133] 8、轉(zhuǎn)基因載體P4的體外pGL-3質(zhì)粒有血清條件下的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) [0134] 將應(yīng)用例2制備的不同質(zhì)量比的陽(yáng)離子聚合物P4與pGL-3質(zhì)粒的復(fù)合物用 opti-MEM稀釋,使pGL-3質(zhì)粒的濃度為10μg/mL溶液的體積為800μL,將以上溶液輕柔吹打混勻；分別用胰酶（美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)）消化收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U-2OS細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）,A549細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）和293T細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為每孔 4 4 7.0×10 ～8.0×10 個(gè)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（美國(guó)Corning公司生產(chǎn)）培養(yǎng)。37℃、5% CO2（法國(guó)JOUAN公司生產(chǎn)）條件下培養(yǎng)約24h,使細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%匯合度,棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基,用PBS緩沖液（濃度為1×）洗1～2次,分別加入上述復(fù)合物溶液100μl,使每種材料與pGL-3質(zhì)粒同質(zhì)量比的處理組均有三個(gè)復(fù)孔,再補(bǔ)充含10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基使每孔內(nèi)的總體積為500μl。37℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育4h后棄轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基,用PBS洗滌1～2次重新加入含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司生產(chǎn)）500μl在相同條件下培養(yǎng)24h,,吸掉培養(yǎng)基,每孔都用500μl預(yù)先冷卻的PBS緩沖溶液（濃度為 1×）洗滌兩次,按照熒光素酶試劑盒生產(chǎn)商（promega）提供的方法,將100 μL（濃度為 1×）的細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞中,室溫下裂解30min后將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至EP管中,14000轉(zhuǎn)/min離心10min,將上層溶液再次轉(zhuǎn)移至另外的EP管中保存在冰塊中,取20μl該裂解溶液到96孔板中,然后加入100μL熒光素酶底物中使它們發(fā)生復(fù)合作用,用酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn)）測(cè)熒光活性,裂解液的蛋白濃度用Thermo Modi?ed Lowry Protein Assay（Thermo,Rockford,IL,USA）測(cè)定,轉(zhuǎn)染效率用相對(duì)熒光活性（RLU）/mg蛋白表達(dá),即RLU/mg protein；轉(zhuǎn)染時(shí)是做的三個(gè)復(fù)孔,轉(zhuǎn)染結(jié)果是三次的平均值。 [0135] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。從圖中可看出,與市售的PEI相比,陽(yáng)離子聚合物基因載體P4與pGL-3質(zhì)粒形成的復(fù)合物在U-2OS細(xì)胞、293T細(xì)胞和A549細(xì)胞中有血清條件下都表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率,其中在U-2OS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率是PEI的10倍,而在293T細(xì)胞和A549 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率與bPEI 25KD差不多。由此說(shuō)明這種通過(guò)環(huán)氧開環(huán)的聚合物基因載體具有一定的細(xì)胞選擇性,這為臨床靶向治療提供了可能性。 [0136] 9、轉(zhuǎn)基因載體P4的體外pEGFP-N1質(zhì)粒有血清條件下的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) [0137] 將上述應(yīng)用例1制備的不同質(zhì)量比的陽(yáng)離子聚合物P4與pEGFP-N1質(zhì)粒的復(fù)合物用opti-MEM稀釋,使pEGFP-N1質(zhì)粒的濃度為10μg/mL溶液的體積為800μL,將以上溶液輕柔吹打混勻；分別用胰酶（美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)）消化收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U-2OS細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）,A549細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）和293T細(xì)胞株（來(lái)源于ATCC）,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為 4 4 每孔7.0×10 ～8.0×10 個(gè)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（美國(guó)Corning公司生產(chǎn)）培養(yǎng)。37℃、 5% CO2（法國(guó)JOUAN公司生產(chǎn)）條件下培養(yǎng)約24h,使細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%匯合度,棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基,用PBS緩沖液（濃度為1×）洗1～2次,分別加入上述復(fù)合物溶液100μl,使每種材料與pEGFP-N1質(zhì)粒同質(zhì)量比的處理組均有三個(gè)復(fù)孔,再補(bǔ)充含10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基使每孔內(nèi)的總體積為500μl。37℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育4h后棄轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基,用PBS洗滌1～2次重新加入含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司生產(chǎn)）500μl在相同條件下培養(yǎng)24h,其后取出細(xì)胞板在倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司生產(chǎn)）下觀察pEGFP蛋白的表達(dá)情況,并采圖。 [0138] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10（該圖只給出P4與pEGFP-N1質(zhì)粒的復(fù)合物在U-2OS細(xì)胞、A549細(xì)胞和293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率分別最佳的質(zhì)量比2、6和4的圖片）。由圖可見,轉(zhuǎn)基因載體P4與pEGFP-N1質(zhì)粒的復(fù)合物在U-2OS細(xì)胞、A549細(xì)胞和293T細(xì)胞中有血清條件都有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá),與市售的bPEI 25kDa相比，都表現(xiàn)出了比bPEI 25kDa更高的轉(zhuǎn)染效率。