一種用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明是關(guān)于動(dòng)物源性食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的一種。 背景技術(shù) [0002] 傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)方法要求對(duì)每個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行非選擇性增菌、選擇性增菌、分離、篩選和鑒定等步驟，一般需要6天才能出具檢測(cè)報(bào)告，嚴(yán)重影響貨物的品質(zhì)和貨架壽命。一些新的技術(shù)如PCR技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、生物芯片技術(shù)等檢測(cè)方法仍依賴于傳統(tǒng)的檢測(cè)步驟，即需要進(jìn)行增菌，耗時(shí)耗力，完成一次檢測(cè)通常需要幾天的時(shí)間。這樣不僅增加了實(shí)驗(yàn)室的工作量，而且也不利于食品工業(yè)中生產(chǎn)流程的監(jiān)測(cè)、終產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及政府部門(mén)對(duì)食品安全的管理和控制。由于進(jìn)出口食品的大量增加，因此急需可靠有效的快速檢測(cè)方法，縮短檢測(cè)時(shí)間，促進(jìn)我國(guó)食品的進(jìn)出口貿(mào)易。 發(fā)明內(nèi)容 [0003] 以受控分子馬達(dá)技術(shù)為核心，集成核酸探針識(shí)別、熒光探針標(biāo)記與檢測(cè)等技術(shù)，建立了一個(gè)全新概念的快速檢測(cè)技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)。在F0F1-ATPase分子馬達(dá)連接上特異的核酸探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明可將檢測(cè)時(shí)間縮短至2天，且檢測(cè) 2 靈敏度能達(dá)到10CFU/ml，滿足現(xiàn)有的食品微生物檢測(cè)范圍。 附圖說(shuō)明 [0004] 附圖1為分子馬達(dá)生物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、γ、ε均為ATP合酶亞基)，1為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為ITS探針， 5為阪崎腸桿菌單鏈DNA。 [0005] 附圖2為chro ITS對(duì)不同種菌株的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本，其中1為水，2為阪崎腸桿菌，3為副溶血性弧菌，4為大腸桿菌，5為沙門(mén)氏菌，6為霍亂弧菌。 具體實(shí)施方式 [0006] 根據(jù)阪崎腸桿菌ITS基因設(shè)計(jì)特異性核酸探針5’-actctgacacaccgcgcattcctg，其中探針的5’用生物素進(jìn)行標(biāo)記。將該探針通過(guò)生物素抗體連接在分子馬達(dá)上面，利用分子馬達(dá)生物傳感器即可對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品為阪崎腸桿菌DNA時(shí)，檢測(cè)體系的熒光值會(huì)發(fā)生明顯的變化，通過(guò)這一變化即可判斷樣本為陽(yáng)性。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)試劑盒，可以方便、快速對(duì)食品中的阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。 [0007] 試劑盒組成： [0008] 編號(hào) 組分名稱 數(shù)量 保存條件 1 Chro ITS 20μl ﹣20℃ 2 合成buffer 10ml 室溫 3 ADP(1.6mol/l) 1ml ﹣20℃ 4 1×PBS 25ml 室溫 5 熒光素酶/熒光素 100個(gè)單位 ﹣20℃ 6 熒光素酶/熒光素重組緩沖液 12ml ﹣20℃ 7 無(wú)菌水 5ml 室溫 [0009] 操作步驟如下： [0010] 1.取1.5ml EP管，加入待測(cè)樣本10μl。 [0011] 2.將上述EP管置于95℃水浴5min，然后轉(zhuǎn)移至50℃水浴1min。 [0012] 3.取2μl chro ITS，用合成buffer稀釋到一定的倍數(shù)。取稀釋后的chro 10μl加入上述EP管。 [0013] 4.另取1個(gè)EP管加入10μl無(wú)菌水置于95℃水浴5min，然后轉(zhuǎn)移至50℃水浴 1min，再加入10μl合成buffer作為本底對(duì)照，短暫振蕩使反應(yīng)體系混勻。 [0014] 5.再向2個(gè)EP管中分別加入30μl啟動(dòng)buffer(啟動(dòng)buffer由ADP(1.6mol/l)和合成buffer按體積比1:3配制，每次實(shí)驗(yàn)按需要取一定的量配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，振蕩使反應(yīng)體系混勻，然后立 即短暫離心以除去管蓋內(nèi)壁上的水珠。 [0015] 6.將上述反應(yīng)體系放入37℃恒溫?fù)u床中溫育10min。 [0016] 7.將EP管從搖床中取出，分別加入200μl PBS緩沖液，振蕩使體系混勻。 [0017] 8.取一塊干凈的96孔板，將2管中的最終反應(yīng)體系加入其中，每個(gè)體系加3孔，每孔加樣50μl，然后對(duì)每個(gè)加樣孔分別加入30μl已配置好的熒光素酶溶液(將熒光素酶/熒光素重組緩沖液加入裝有熒光素酶/熒光素的棕色玻璃瓶中，蓋上瓶塞，反復(fù)顛倒幾次混勻，不可振蕩。使用前應(yīng)將混合液在室溫放置1h)，用槍反復(fù)吹打幾次使體系混勻。 [0018] 9.將96孔板上機(jī)檢測(cè)，處理數(shù)據(jù)，對(duì)各組數(shù)據(jù)取平均值，然后用樣本數(shù)值減去本底數(shù)值即為樣本的實(shí)際熒光值。 [0019] 通過(guò)實(shí)驗(yàn)，分子馬達(dá)生物傳感器chro ITS具有良好的特異性，用chro ITS對(duì)水、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌進(jìn)行檢測(cè)，阪崎腸桿菌的熒光值明顯高于水和其他對(duì)照菌的熒光值，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)下表，結(jié)果見(jiàn)附圖2。 [0020] 樣品(40ng/mL) 熒光值 水 284994 阪崎腸桿菌 391027 副溶血性弧菌 309041 大腸桿菌 328063