一種改良共變性熒光原位雜交方法 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明涉及一種熒光原位雜交技術(shù)，尤其涉及了一種改良共變性熒光原位雜交方法。 背景技術(shù) [0002] 熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種重要的原位雜交方法，以非放射性熒光標(biāo)記取代放射性同位素標(biāo)記，而形成的一種新的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，與放射性同位素標(biāo)記的探針相比具有明顯的優(yōu)勢： [0003] 1.熒光試劑和探針較放射性同位素標(biāo)記的探針更加經(jīng)濟安全； [0004] 2.探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用； [0005] 3.實驗結(jié)果靈敏度高，特異性好，定位準(zhǔn)確； [0006] 4.多色FISH可通過在同一個核中顯示不同的顏色，同時檢測多種序列； [0007] FISH技術(shù)不但可以用于已知基因或序列的染色體定位，而且可以用于動物、植物、微生物克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究，此外，F(xiàn)ISH技術(shù)在基因定性、定量、整合和表達方面的研究中具有優(yōu)勢。但是，目前廣泛使用的經(jīng)典熒光原位雜交方法中，關(guān)鍵的雜交步驟操作復(fù)雜，步驟繁瑣，極大地降低了實驗效率，為實驗帶來了極大的不確定性，此外，經(jīng)典雜交步驟中需要使用具有毒性的變性試劑，威脅了實驗操作人員的身體健康，也給環(huán)境造成了危害。 發(fā)明內(nèi)容 [0008] 本發(fā)明針對經(jīng)典熒光原位雜交技術(shù)操作復(fù)雜，步驟繁瑣，實驗效率低，且需要使用有毒致畸試劑的缺點，提供了一種操作簡便，步驟簡單、實驗效率高，且不使用有毒致畸試劑的共變性熒光原位雜交方法。 [0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決： [0010] 一種改良共變性熒光原位雜交方法，包括如下步驟： [0011] 步驟一制備玻片標(biāo)本：樣品經(jīng)過EDTA-胰酶消化、低滲液處理、固定液固定處理后，滴片并烘烤，制得玻片標(biāo)本； [0012] 步驟二探針與染色體共變性和雜交：在玻片標(biāo)本上，滴加探針溶液，加蓋蓋玻片后，封蓋蓋玻片與載玻片間的交界縫后，烘烤玻片標(biāo)本，使探針與樣品染色體共變性，共變性完成后，將玻片標(biāo)本置于濕盒中孵育； [0013] 步驟三雜交后洗滌并染色：孵育完成后，取出玻片標(biāo)本，移除封蓋蓋玻片與載玻片間交界縫的膠水，用SSC洗滌液洗滌玻片標(biāo)本后，染色處理； [0014] 步驟四信號檢測：用熒光顯微鏡檢測玻片標(biāo)本。 [0015] 經(jīng)過前處理后的樣本經(jīng)EDTA-胰酶處理，EDTA（乙二胺四乙酸）作為螯合劑，結(jié)合金屬離子，消除重金屬離子對酶的抑制作用，EDTA-胰酶消化細胞外的蛋白質(zhì)。樣品浸入低滲液中，低滲液滲透壓低于細胞內(nèi)的滲透壓，水分迅速進入細胞，使細胞膨脹，染色體鋪展，使黏附于染色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)，從而獲得良好的染色體分裂相，有利于后續(xù)實驗結(jié)果的觀察，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。固定液能迅速穿透細胞，將細胞固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。加入探針的玻片標(biāo)本密封后，經(jīng)過烘烤，高溫使探針和待檢測樣品同時發(fā)生變性，染色體脫氧核糖核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，形成單鏈，變形完成后，溫度降低，孵育探針和待檢測樣品，小分子探針與靶序列由于堿基互補配對結(jié)合，探針插入到待測樣品中，指示靶序列的存在，指示染色體異常。雜交完成后，用SSC洗滌液洗滌玻片標(biāo)本，洗去未結(jié)合的探針，避免未結(jié)合的探針顯影，干擾檢測結(jié)果。本發(fā)明的改良共變性熒光原位雜交中，探針與待檢測樣本的雜交過程不需經(jīng)過乙醇的梯度脫水作用，免除了乙醇預(yù)冷凍等實驗準(zhǔn)備步驟，節(jié)約了大量試劑，降低了實驗成本，此外，雜交過程不需要使用有毒的甲酰胺試劑，也免除了甲酰胺試劑的預(yù)熱工作，有利于實驗操作人員的身體健康，減少了環(huán)境污染，也極大地降低了實驗操作復(fù)雜性，提高了實驗效率，此外，簡化實驗步驟，也有利于提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 [0016] 作為優(yōu)選，步驟一中，低滲液為氯化鉀和檸檬酸鈉的混合水溶液，固定液為甲醇和乙酸的混合液。低滲液滲透壓低于細胞內(nèi)液，水分迅速進入細胞，使其膨脹，同時可使黏附于染色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)，獲得分散良好的染色體分裂相。氯化鉀和檸檬酸鈉的混合水溶液作為低滲液，具有使染色體輪廓清楚，可染色性強，染色時間短的優(yōu)點。固定液能迅速穿透細胞，將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果，固定液為甲醇和乙酸混合配制成的固定液，可改變甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細胞膨脹、染色體鋪展，但易導(dǎo)致細胞破裂、染色體散失，實際使用中，可根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果調(diào)整以適應(yīng)于不同的待檢樣品。