一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明屬于食品檢測與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測黃曲霉毒素的絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器。 背景技術(shù) [0002] 黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，主要有B1、B2、G1、G2以及另外兩種代謝產(chǎn)物M1、M2。其中M1 和M2是從牛奶中分離出來的。B1、B2、G1、G2、M1 和 M2 在分子結(jié)構(gòu)上十分接近。 [0003] 黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，其致癌力比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，黃曲霉毒素Bl的半數(shù)致死量為0.36mg/kg體重，屬特劇毒的毒物范圍。它引起人的中毒主要是損害肝臟，發(fā)生肝炎肝硬化，肝壞死等。臨床表現(xiàn)有胃部不適、食欲減退，惡心嘔吐，腹脹及肝區(qū)觸痛等，嚴(yán)重者出現(xiàn)水腫昏迷，以至抽搐而死。 [0004] 黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無法避免，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，黃曲霉毒素超標(biāo)的玉米并不少見。國家衛(wèi)生部門禁止企業(yè)使用被嚴(yán)重污染的糧食進(jìn)行食品加工生產(chǎn)，并制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)督企業(yè)執(zhí)行。但黃曲霉毒素即使含量很低依舊會(huì)對人體健康造成侵害，很難進(jìn)行控制。 [0005] 1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15μg/kg；美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量（指B1+B2+G1+G2的總量）不能超過15μg/kg；人類消費(fèi)的牛奶中的含量不能超過0.5μg/kg，其他動(dòng)物飼料中的含量不能超過300μg/kg。而歐盟國家規(guī)定更加嚴(yán)格，花生和堅(jiān)果及其加工產(chǎn)品、所有谷類食品及加工產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1限量為2.0μg/kg；原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中M1限量為 0.050μg/kg；嬰兒食品（包括嬰幼兒奶）中M1限量為0.025μg/kg。 [0006] 目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)都在使用薄膜層析法和液相色譜法進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測。由于其檢測周期長，程序復(fù)雜所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。 本發(fā)明采用絲網(wǎng)印刷電極，價(jià)格低廉，結(jié)合電化學(xué)技術(shù)和競爭免疫分析方法，提高了傳感器的選擇性并大大提高了檢測的靈敏度，節(jié)省了檢測時(shí)間，降低了檢測成本。 發(fā)明內(nèi)容 [0007] 本發(fā)明的目的在于避免傳統(tǒng)檢測方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測人員要求高、檢測成本高等缺點(diǎn)，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡便且價(jià)廉易得的檢測黃曲霉毒素的絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器的制備方法。 [0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。 [0009] 1. 一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟： [0010] （1）負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的制備 [0011] 將粒徑20~60nm的納米羥基磷灰石和硫酸銅以質(zhì)量比為1:1~5的比例混合，溶于 5~15mL水中，震蕩12~24小時(shí)，離心分離； [0012] 取5~10 mg獲得的負(fù)載銅離子的納米羥基磷灰石，溶于5~15mL磷酸鹽緩沖溶液，加入0.1~0.2ml濃度為1μg/mL 的黃曲霉毒素抗原溶液，孵化震蕩4~8小時(shí)，離心分離； [0013] 將獲得的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原重新加入5~15mL磷酸鹽緩沖溶液，并加入1mg的牛血清白蛋白，孵化震蕩4~8小時(shí)，離心分離； [0014] 將沉淀重新分散到5~10mL磷酸鹽緩沖溶液中，即獲得負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的儲(chǔ)備液； [0015] （2）競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備 [0016] 在絲網(wǎng)印刷電極上加入50μL含有 0.05mmol/L硝酸銀、0.2mmol/L檸檬酸鈉和 0.05mol/L硝酸鉀的水溶液，連接電化學(xué)工作站，以-0.2V 進(jìn)行恒電位沉積，沉積時(shí)間為 30~180s，晾干，制得銀納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷電極； [0017] 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL濃度為1μg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； [0018] 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL的濃度為1%牛血清白蛋白溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； [0019] 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL的體積比為1~5:1的黃曲霉毒素、負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原混合溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器。 [0020] 2. 一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，用于黃曲霉毒素的檢測包括以下步驟： [0021] （1）工作曲線的繪制 [0022] 采用不同濃度的黃曲霉毒素按照1中所述的方法制備一系列絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器；

1.一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： （1）負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的制備 將粒徑20~60nm的納米羥基磷灰石和硫酸銅以質(zhì)量比為1:1~5的比例混合，溶于 5~15mL水中，震蕩12~24小時(shí)，離心分離； 取5~10 mg獲得的負(fù)載銅離子的納米羥基磷灰石，溶于5~15mL磷酸鹽緩沖溶液，加入 0.1~0.2ml濃度為1μg/mL 的黃曲霉毒素抗原溶液，孵化震蕩4~8小時(shí)，離心分離； 將獲得的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原重新加入5~15mL磷酸鹽緩沖溶液，并加入1mg的牛血清白蛋白，孵化震蕩4~8小時(shí)，離心分離； 將沉淀重新分散到5~10mL磷酸鹽緩沖溶液中，即獲得負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的儲(chǔ)備液； （2）競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備 在絲網(wǎng)印刷電極上加入50μL含有 0.05mmol/L硝酸銀、0.2mmol/L檸檬酸鈉和 0.05mol/L硝酸鉀的水溶液，連接電化學(xué)工作站，以-0.2V 進(jìn)行恒電位沉積，沉積時(shí)間為 30~180s，晾干，制得銀納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷電極； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL濃度為1μg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL的濃度為1%牛血清白蛋白溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5~10μL的體積比為1~5:1的黃曲霉毒素、負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原混合溶液，孵化1~4小時(shí)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器。 2.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的傳感器在檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用，包括以下步驟： （1）工作曲線的繪制 采用不同濃度的黃曲霉毒素按照權(quán)利要求1中所述的方法制備一系列競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器； 將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入50μL的醋酸鹽緩沖溶液，再加入5~10μL的1%的稀硫酸溶液，將負(fù)載銅離子的羥基磷灰石溶解，釋放出銅離子； 設(shè)定電位范圍為-0.6~0.4V，沉積電位為-0.8V，沉積時(shí)間為100~300s，通過陽極溶出線性伏安法檢測修飾好的絲網(wǎng)印刷電極的電流響應(yīng)； 根據(jù)所得電流響應(yīng)與黃曲霉毒素濃度的關(guān)系，繪制工作曲線； （2）黃曲霉毒素的檢測 采用5~10μL待測樣品取代步驟（1）中的黃曲霉毒素，其它與步驟（1）相同；