一種體外DNA-to-Protein(D2P)的合成體系、制劑、試劑盒及 制備方法 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種體外DNA-to-Protein(D2P)的合成體系、制劑、試劑盒及制備方法。 背景技術(shù) [0002] 傳統(tǒng)的生物合成系統(tǒng)是指通過模式生物細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)外源基因的一種分子生物學(xué)技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，無細(xì)胞表達(dá)體系，也稱為體外蛋白合成系統(tǒng)，應(yīng)運(yùn)而生。體外蛋白合成系統(tǒng)是指以外源目的mRNA或DNA為模板，通過人工控制補(bǔ)加蛋白質(zhì)合成所需的底物和轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)蛋白因子等物質(zhì)，能實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的合成。 體外蛋白合成系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)無需進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞收集和破碎步驟，是一種相對快速、省時(shí)、便捷的蛋白質(zhì)表達(dá)方式。 [0003] 商業(yè)上的體外合成系統(tǒng)有兩種：一種以預(yù)先體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA作為模板翻譯合成蛋白質(zhì)，另一種是將體外轉(zhuǎn)錄與體外翻譯同時(shí)進(jìn)行，以DNA為模板合成mRNA然后合成蛋白質(zhì)。這兩種系統(tǒng)都比較復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)要求較高，需要使用者預(yù)先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)以獲得足夠多的mRNA模板，或者需要預(yù)先提供大量的DNA或者高濃度的質(zhì)粒作為模板(模板的質(zhì)量甚至大于合成蛋白質(zhì)的質(zhì)量)。這些弊端增加了使用者的操作時(shí)間、制造成本、及實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性，同時(shí)也大大限制了生物合成的效率和產(chǎn)量。因此，開發(fā)一種更簡單、方便、高效率、高產(chǎn)量、低成本的體外生物合成系統(tǒng)已成為基礎(chǔ)生物研究領(lǐng)域的迫切需要。 發(fā)明內(nèi)容 [0004] 本發(fā)明提供了一種同時(shí)在體外進(jìn)行DNA,RNA,蛋白質(zhì)生物合成的理論模型和設(shè)計(jì)。 [0005] 本發(fā)明提供了一種簡單、方便、高效率、高產(chǎn)量、低成本的體外合成系統(tǒng)。 [0006] 本發(fā)明提供一種以DNA模板進(jìn)行體外合成DNA,RNA,蛋白質(zhì)方法的建立。 [0007] 本發(fā)明提供一種以微量DNA模板進(jìn)行體外合成蛋白質(zhì)方法的建立及優(yōu)化，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷與不足。 [0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是偶聯(lián)DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及翻譯的體外合成系統(tǒng)的理論構(gòu)建；本發(fā)明的第二個(gè)目的是偶聯(lián)DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及翻譯的體外合成系統(tǒng)的建立及優(yōu)化；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種簡單可行的偶聯(lián)DNA-to-Protein(D2P)的體外生物合成制劑。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種簡單、高產(chǎn)量的體外蛋白質(zhì)合成試劑盒。 [0009] 本發(fā)明第一方面提供了一種體外的無細(xì)胞的合成體系理論的建立，所述無細(xì)胞的合成體系包括： [0010] (p1)體外外源DNA合成體系； [0011] (p2)合成的DNA-to-mRNA合成體系； [0012] (p3)合成的mRNA-to-Protein合成體系； [0013] (p4)關(guān)聯(lián)p1-p2-p3的DNA序列設(shè)計(jì)，酶的設(shè)計(jì)； [0014] (p5)實(shí)現(xiàn)體外無細(xì)胞DNA-to-Protein(D2P)合成的系統(tǒng)性理論和定量評估； [0015] (p6)D2P體系實(shí)現(xiàn)高效蛋白質(zhì)合成的理論模型建立。 [0016] 本發(fā)明第二方面提供了一種偶聯(lián)DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及翻譯的體外無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，所述的合成體系包括： [0017] (a)DNA聚合酶； [0018] (b)解旋酶； [0019] (c)DNA結(jié)合蛋白； [0020] (d)用于合成DNA的底物； [0021] (e)RNA聚合酶； [0022] (f)用于合成RNA的底物； [0023] (g)用于合成蛋白的底物； [0024] (h)細(xì)胞提取物； [0025] 在另一優(yōu)選例中，所述無細(xì)胞的蛋白合成體系還包括選自下組的組分： [0026] (j1)鎂離子； [0027] (j2)鉀離子； [0028] (j2)緩沖劑； [0029] (j3)能量再生系統(tǒng)； [0030] (j4)聚乙二醇； [0031] (j5)任選的外源蔗糖； [0032] (j6)任選的溶劑，所述溶劑為水性溶劑。 [0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的DNA聚合酶包括：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Bst?DNA聚合酶、Ecoli?DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段等用于恒溫?cái)U(kuò)增的聚合酶及突變體，并不局限于此。 [0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的解旋酶包括：T7噬菌體復(fù)制系統(tǒng)的解旋酶(4B)、UvrD解旋酶等。 [0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的DNA結(jié)合蛋白包括：T4噬菌體基因32蛋白、RB49噬菌體基因32蛋白、T7噬菌體復(fù)制系統(tǒng)的單鏈結(jié)合蛋白，DNA結(jié)合蛋白7等。 [0036] 所述的合成DNA的底物包括：脫氧核苷單磷酸、脫氧核苷三磷酸、或其組合。 [0037] 所述的合成RNA的底物包括：核苷單磷酸、核苷三磷酸、或其組合。 [0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的合成蛋白的底物包括：1-20種天然氨基酸、以及非天然氨基酸。