[0166] 圖2是在phi29DNA聚合酶復(fù)制體系中不同體積的DNA對(duì)于體外蛋白合成體系的影響示意圖。phi29DNA聚合酶的反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為6-16h，含有螢光素酶基因的質(zhì)粒為1ng。NC為負(fù)對(duì)照，沒(méi)有DNA的體外合成體系。PC為正對(duì)照，DNA來(lái)自于PCR反應(yīng)，約500ng。 從圖上可以看出，0.5-3微升的phi29DNA聚合酶復(fù)制的DNA均可以用作體外轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系。 [0167] 圖3是在phi29DNA聚合酶復(fù)制體系中，不同反應(yīng)時(shí)間的DNA對(duì)于體外蛋白合成體系的影響示意圖。phi29DNA聚合酶的反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為1-28天，含有熒光素酶基因的質(zhì)粒為1ng。NC為負(fù)對(duì)照，沒(méi)有DNA的體外合成體系。PC為正對(duì)照，DNA來(lái)自于PCR反應(yīng)，約 500ng。從圖上可以看出，1-28天的phi29DNA聚合酶復(fù)制的DNA仍可以用作體外轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系。 [0168] 圖4是在復(fù)制體系中不同濃度phi29DNA聚合酶擴(kuò)增的DNA對(duì)于體外蛋白合成體系的影響示意圖。phi29DNA聚合酶的反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為6-16h，含有eGFP基因的質(zhì)粒為1ng，phi29聚合酶的反應(yīng)濃度為0.5mg/mL-0.8ug/mL。NC為負(fù)對(duì)照，沒(méi)有DNA的體外合成體系。PC為正對(duì)照，DNA來(lái)自于PCR反應(yīng)，約500ng。從圖上可以看出，0.8mg/mL-0.4ug/mL的phi29DNA聚合酶復(fù)制的DNA均可以用作體外轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系。 [0169] 圖5是phi29DNA擴(kuò)增體系不同時(shí)間點(diǎn)合成的DNA模板對(duì)于體外蛋白合成體系的影響示意圖。phi29DNA聚合酶的反應(yīng)溫度為20-30℃，反應(yīng)時(shí)間為0-24h，含有eGFP基因的質(zhì)粒為1ng。NC為負(fù)對(duì)照，沒(méi)有DNA的體外合成體系。PC為正對(duì)照，DNA來(lái)自于PCR反應(yīng)，約500ng。從圖上可以看出，DNA擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到6h時(shí)，擴(kuò)增得到的DNA指導(dǎo)合成的eGFP的量達(dá)到最高值，進(jìn)入平臺(tái)。 [0170] 圖6是使用瓊脂糖凝膠對(duì)圖5中phi29DNA擴(kuò)增體系不同時(shí)間點(diǎn)合成的DNA量的分析示意圖。從圖上可以看出，DNA擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到6h時(shí)，擴(kuò)增得到的DNA的量達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的增加進(jìn)入平臺(tái)，不再有顯著增加。 [0171] 圖7是使用Western?Blot的方法檢測(cè)IVDTT合成的eGFP。泳道1是加入含有eGFP編碼序列的質(zhì)粒的IVDTT體系，泳道2是不加入DNA模板的IVDTT體系(陰性對(duì)照)。Western?Blot使用了eGFP蛋白的一抗，泳道1條帶的分子量大小與理論分子量(26.7KDa)非常接近，這表明合成的目標(biāo)蛋白是正確的eGFP蛋白。 [0172] 圖8是使用熒光SDS-PAGE成像方法檢測(cè)IVDTT合成的eGFP蛋白。泳道1是加入含有eGFP編碼序列的質(zhì)粒的IVDTT體系，泳道2是不加入DNA模板的IVDTT體系(陰性對(duì)照)。在SDS-PAGE分析中，eGFP蛋白中的熒光基團(tuán)在不完全變性的情況下還能夠受激發(fā)并發(fā)出熒光。泳道1中檢測(cè)到的熒光條帶的分子量大小與eGFP的理論分子量(26.7KDa)非常接近，這表明合成的eGFP蛋白能夠受激發(fā)并發(fā)出熒光。 [0173] 圖9是使用IVDTT體系合成的融合蛋白Ubiquitin-eGFP和單獨(dú)eGFP受激后發(fā)出的相對(duì)熒光值(RFU)，測(cè)量了體外合成體系孵育3h(空白的柱狀圖)和20h(帶有陰影的柱狀圖)后合成的融合蛋白中eGFP和單獨(dú)的eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值(RFU)，合成的單獨(dú)eGFP作為IVDTT體系的正對(duì)照。合成的Ubiquitin-eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值比陰性對(duì)照(NC)的相對(duì)熒光值顯著高，表明IVDTT體系合成了融合蛋白Ubiquitin-eGFP。 [0174] 圖10是使用IVDTT體系合成的融合蛋白p53-eGFP和單獨(dú)eGFP受激后發(fā)出的相對(duì)熒光值，測(cè)量了體外合成體系孵育3h(空白的柱狀圖)和20h(帶有陰影的柱狀圖)后合成的融合蛋白中eGFP和單獨(dú)的eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值(RFU)，合成的單獨(dú)eGFP作為IVDTT體系的正對(duì)照。合成的p53-eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值比陰性對(duì)照的相對(duì)熒光值顯著高，表明IVDTT體系合成了融合蛋白p53-eGFP。 [0175] 圖11是使用IVDTT體系合成的融合蛋白β2AR-eGFP和單獨(dú)eGFP受激后發(fā)出的相對(duì)熒光值，測(cè)量了體外合成體系孵育3h(空白的柱狀圖)和20h(帶有陰影的柱狀圖)后合成的融合蛋白中eGFP和單獨(dú)的eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值(RFU)，合成的單獨(dú)eGFP作為IVDTT體系的正對(duì)照。合成的β2AR-eGFP發(fā)出的相對(duì)熒光值比陰性對(duì)照的相對(duì)熒光值顯著高，表明IVDTT體系合成了融合蛋白β2AR-eGFP。