一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2及其克隆和應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2及其克隆和應(yīng)用。 背景技術(shù) [0002] 花生是世界重要的油料作物，其籽仁中蛋白質(zhì)含量為24％～36％；含油量高達(dá) 38％～60％，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)對花生籽仁中蛋白質(zhì)、油脂及其它營養(yǎng)成分進(jìn)行遺傳改良或以花生籽仁作為“生物反應(yīng)器”異源合成蛋白疫苗的報(bào)道將會(huì)陸續(xù)出現(xiàn)。啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在宿主植物中表達(dá)，是花生遺傳改良重要的分子工具。 [0003] 自1993年獲得轉(zhuǎn)基因花生植株以來，陸續(xù)出現(xiàn)了以抗逆、品質(zhì)改良等為目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因花生的報(bào)道。迄今為止，此類研究大都使用植物組成型表達(dá)啟動(dòng)子(即目的外源基因在植物整株中表達(dá))。然而，在植物所有組織中持續(xù)高效表達(dá)目的基因也會(huì)給植物生長發(fā)育帶來不利影響。組織特異啟動(dòng)子作為一類專一性啟動(dòng)子，能指導(dǎo)外源基因在植物發(fā)育過程中某一特定時(shí)空表達(dá)，它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定空間積累，增加區(qū)域表達(dá)量，而且也避免了植物營養(yǎng)的浪費(fèi)。因此，花生種子特異啟動(dòng)子將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 [0004] 利用多基因聚合技術(shù)，以高等植物種子作為“生物反應(yīng)器”異源合成營養(yǎng)物質(zhì)的研究越來越熱。比如，能生產(chǎn)維生素A的金色大米、可產(chǎn)魚油的油菜籽、能異源合成花青素的紫晶大米以及紫胚玉米等。這些“營養(yǎng)強(qiáng)化型”農(nóng)作物的獲得均需要引進(jìn)外源代謝途徑，而外源代謝途徑涉及的基因需借助啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。研究報(bào)道稱，多基因轉(zhuǎn)化時(shí)，如果每個(gè)基因使用相同序列的啟動(dòng)子，由于重復(fù)序列的大量存在，可能會(huì)造成轉(zhuǎn)基因沉默，最好每個(gè)基因表達(dá)盒選擇使用不同序列的啟動(dòng)子。因此，若想借助花生種子作為“生物反應(yīng)器”異源合成營養(yǎng)物質(zhì)，獲得“營養(yǎng)強(qiáng)化型”花生，需要克隆鑒定大量花生種子特異啟動(dòng)子。本發(fā)明啟動(dòng)子的克隆鑒定為下一步以花生種子作為“生物反應(yīng)器”，獲得“營養(yǎng)強(qiáng)化型”花生提供了種子特異啟動(dòng)子資源，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 發(fā)明內(nèi)容 [0005] 本發(fā)明提供了一種花生種子特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子AHSSP2及其克隆和應(yīng)用，本發(fā)明在花生中克隆到一個(gè)1970bp的啟動(dòng)子片段AHSSP2，經(jīng)生物信息學(xué)分析、RT-PCR以及轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，確定AHSSP2是一個(gè)能驅(qū)動(dòng)外源基因在種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。 [0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： [0007] 一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2，其具有如SEQ?ID?No:1所示的核苷酸序列。 [0008] 進(jìn)一步的，所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2含有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)TATA?box、CAAT?box和3個(gè)種子特異表達(dá)元件RYREPEAT。 [0009] 進(jìn)一步的，擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的引物AHSSP2-F和AHSSP2-R的序列為： [0010] AHSSP2-F：5’-AAGCTTATTTTAATTAACTATTTTTCTAATTAGTTC-3’； [0011] AHSSP2-R：5’-GGATCCGGTGGTGGTGGAATGTGATGATGCTTGAGGAG-3’。 [0012] 進(jìn)一步的，擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的PCR反應(yīng)體系為：ddH2O?31μL，含Mg2+的5x?HF?buffer?10μL；濃度為2.5mM的dNTP?2?μL；濃度為5μM的AHSSP2-F和AHSSP2-R各2μL；DMSO?0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因組模板2μL。 [0013] 進(jìn)一步的，擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性 30s；98℃變性10s，58℃退火10s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。 [0014] 一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2在驅(qū)動(dòng)外源基因在植物種子中特異表達(dá)的應(yīng)用。 [0015] 進(jìn)一步的，所述外源基因?yàn)镚US基因。 [0016] 含有上述一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2的植物表達(dá)載體pBI121-AHSSP2。 [0017] 進(jìn)一步的，所述的植物表達(dá)載體pBI121-AHSSP2在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。 [0018] 一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2的植物表達(dá)載體pBI121-AHSSP2的構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對pEASY-B-AHSSP2和植物表達(dá)載體pBI121分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到的片段經(jīng)純化后，在T4連接酶的作用下連接在一起，得到質(zhì)粒pBI121-AHSSP2。 [0019] 進(jìn)一步的，所述pEASY-B-AHSSP2是通過擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2，回收擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-Blunt?simple載體連接、熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆進(jìn)行測序，經(jīng)測序正確后得到的。

1.一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2，其特征在于：其具有如SEQ?ID?No:1所示的核苷酸序列；擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的引物AHSSP2-F和AHSSP2-R的序列為： AHSSP2-F：5’-AAGCTTATTTTAATTAACTATTTTTCTAATTAGTTC-3’； AHSSP2-R：5’-GGATCCGGTGGTGGTGGAATGTGATGATGCTTGAGGAG-3’。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2，其特征在于：擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的PCR反應(yīng)體系為：ddH2O31μL，含Mg2+的5x?HF?buffer?10μL； 濃度為2.5mM的dNTP2μL；濃度為5μM的AHSSP2-F和AHSSP2-R各2μL；DMSO?0.6μL；Phusion酶 0.5μL；基因組模板2μL。 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2，其特征在于：擴(kuò)增所述花生種子特異啟動(dòng)子AHSSP2的PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，58℃退火 10s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2在驅(qū)動(dòng)外源基因在花生和擬南芥種子中特異表達(dá)的應(yīng)用。 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2在驅(qū)動(dòng)外源基因在花生和擬南芥種子中特異表達(dá)的應(yīng)用，其特征在于：所述外源基因?yàn)镚US基因。 6.一種含有權(quán)利要求1所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2的植物表達(dá)載體pBI121-AHSSP2。 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種花生種子特異表達(dá)啟動(dòng)子AHSSP2的植物表達(dá)載體pBI121-AHSSP2的構(gòu)建方法，其特征在于：用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對pEASY-B-AHSSP2和植物表達(dá)載體pBI121分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到的片段經(jīng)純化后，在T4連接酶的作用下連接在一起，得到質(zhì)粒pBI121-AHSSP2。