基于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV的檢測方法及 應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV的檢測方法及應(yīng)用。 背景技術(shù) [0002] 肝炎是在世界范圍內(nèi)廣泛流行的嚴(yán)重危害人體健康甚至生命的嚴(yán)重疾病，目前主要分為甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎。根據(jù)傳播途徑可將其分為兩大類，其中乙型、丙型、丁型、庚型肝炎的主要傳播途徑為血液傳播、醫(yī)源性傳播、母嬰傳播、性傳播，其中血液傳播和性傳播為最常見途徑。甲型和戊型肝炎的主要通過糞-口途徑傳播。 [0003] 1985年，當(dāng)PCR方法成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法后，導(dǎo)致了分子生物學(xué)指數(shù)級的進(jìn)步。目前建立的特異性核酸分子檢測通常需要分為兩步，第一步是目的核酸的擴(kuò)增，第二步是目的核酸檢測。PCR技術(shù)是最先建立也是目前最常用的擴(kuò)增方法，目前在PCR方法基礎(chǔ)上，引入了熒光標(biāo)記的探針，可以實(shí)時檢測靶標(biāo)的擴(kuò)增情況，稱為Realtime?PCR。Realtime?PCR不僅是快速、高靈敏的檢測方法，同時這種方法也可以進(jìn)行定量分析。但是常規(guī)PCR檢測需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程序，且耗時較長，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場檢測的要求。與傳統(tǒng)PCR相比，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase?poly-merase?amplification，RPA)一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其最顯著的優(yōu)勢就是可在37-42℃的恒溫下實(shí)現(xiàn)特定核酸序列的擴(kuò)增，可以在10～40min內(nèi)完成數(shù)十億的DNA拷貝。RPA屬于等溫擴(kuò)增技術(shù)，對儀器設(shè)備要求低，僅需要恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)，無需精密儀器。 [0004] CRISPR-Cas是細(xì)菌抵抗病毒和質(zhì)粒侵染的獲得性免疫防御系統(tǒng)，幾乎存在于所有的古菌和約50％的現(xiàn)代細(xì)菌。CRISPR-Cas平臺是出色的基因組編輯工具，其層出不窮的科研進(jìn)展及其應(yīng)用更新給生物學(xué)界帶來巨大革命。CRISPR-Cas系統(tǒng)劃分為兩大類，第一大類CRISPR系統(tǒng)要由多個Cas蛋白組成的效應(yīng)復(fù)合物才能發(fā)揮功能；第二大類Cas是依靠單個Cas效應(yīng)蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)就能發(fā)揮功能。 [0005] 2015年，張鋒等人發(fā)現(xiàn)了新的CRISPR相關(guān)蛋白內(nèi)切酶Cas12a(之前稱為Cpf1)，它與常用的Cas9蛋白一樣是RNA引導(dǎo)的特異性DNA核酸內(nèi)切酶，但與相比Cas9，Cas12a又有它自身特點(diǎn)，比如僅需要crRNA即可引導(dǎo)特異性切割雙鏈DNA，并產(chǎn)生粘性末端等。Cas12a一旦識別并切割由crRNA序列指定的靶標(biāo)DNA，它就轉(zhuǎn)入了一種酶促“激活”狀態(tài)，這時它能將任意非靶標(biāo)的單鏈DNA切成碎片。這種作用稱之為附屬活性。 發(fā)明內(nèi)容 [0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV的檢測方法及應(yīng)用，通過采用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)提高檢測靈敏度，且是一種快速、低成本、高準(zhǔn)確度、高敏感性和設(shè)備簡單的檢測方法。 [0007] 為解決上述問題， [0008] 一方面，本發(fā)明在于提供一種基于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV的檢測方法，包括如下步驟： [0009] 1)制備RPA產(chǎn)物：以HBV患者血清中提取到的DNA為模板，將含擴(kuò)增引物對、重泡脹緩沖液、ddH2O的RPA反應(yīng)體系加入凍干酶粉中，再加入MgAc混勻，孵育，得到RPA產(chǎn)物； [0010] 2)制備PS2.M/Hemin溶液：PS2.M?DNA溶解在Tris-HCL溶液，向溶液中加入Hemin(血紅素)溶液，制得PS2.M/Hemin溶液； [0011] 3)制備Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液：將FnCas12a和HBV?crRNA加入到Tris-HCl緩沖液中，孵育，制得Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液； [0012] 4)檢測HBV：將RPA產(chǎn)物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2處理后測定吸光度。 [0013] 進(jìn)一步地，步驟1)中，所述DNA提取采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒進(jìn)行提取。 [0014] 進(jìn)一步地，步驟1)中，所述擴(kuò)增引物對包括RPA引物對1 [0015] RPA-1上游引物:5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'， [0016] RPA-1下游引物:5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'； [0017] RPA引物對2 [0018] RPA-2上游引物:5'AGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATT3'， [0019] RPA-2下游引物：5'AGAAGATTGACGATATGGGTGAGGCAGTAG3'；

1.一種用于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV?檢測方法中的試劑，其特征在于，包括PS2.M/Hemin溶液和Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液； 其中，所述檢測方法步驟如下： 1）制備RPA產(chǎn)物：以HBV患者血清中提取到的DNA為模板，將含擴(kuò)增引物對、重泡脹緩沖液、ddH2O的RPA反應(yīng)體系加入凍干酶粉中，再加入MgAc混勻，孵育，得到RPA產(chǎn)物； 2）制備PS2.M/Hemin溶液：PS2.M?DNA溶解在Tris-HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液； 3）制備Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液：將FnCas12a和HBV?crRNA加入到Tris-HCl緩沖液中，孵育，制得Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液； 4）檢測HBV：將RPA產(chǎn)物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA復(fù)合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2處理后測定吸光度； 所述DNA提取采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒進(jìn)行提??； 所述擴(kuò)增引物對包括RPA引物對1、 RPA-1上游引物:?5'CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC3'， RPA-1下游引物:?5'GCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTA3'； 步驟1）中，所述孵育過程如下：渦旋混勻后，37℃水浴鍋中孵育20?min。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV?檢測方法中的試劑，其特征在于，所述Tris-HCL溶液的濃度為20?mm/L，PH7.5，含100?mm/L?KCl、40?mm/L?MgCl2、0.008%?Triton?X-100；所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于CRISPR-Cas12a和G四鏈體-血紅素的HBV?檢測方法中的試劑，其特征在于，所述FnCas12a的制備過程如下：使用化學(xué)合成法進(jìn)行FnCas12基因合成，并將FnCas12克隆入PET-32a原核表達(dá)載體中；經(jīng)Sanger法測序鑒定插入序列正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli.?BL21；用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6His-TRX-TCRP1融合蛋白，進(jìn)行His親和層析純化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His標(biāo)簽，并純化鑒定FnCas12蛋白。