[0032] 將2mg總RNA在37℃下溫育20分鐘，加入或不加入3U/mg?RNase?R，隨后使用RNeasy?MinElute試劑盒。對于放線菌素D處理，將2mg總RNA在37℃下與或不加入1mg放線菌素(放線菌素D，Sigma，成都最好的試劑公司)一起溫育，并且在0,6,12,18小時(shí)分別檢測所得RNA。 [0033] 2.患者及病例篩選 [0034] 從GC患者中共收集到64個(gè)GC組織和相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織樣品，所有組織樣品均來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院普外科(2011年1月至2017年12月期間)。所有入組患者在術(shù)前均行放療和化療，并將他們的組織樣本立即儲存在RNA固定試劑中，并立即放入-80℃冰箱中保存。配對的相鄰非腫瘤組織需通過病理分析沒有腫瘤細(xì)胞，并且定位在距離瘤體邊緣5cm處。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟的腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)，所有腫瘤均準(zhǔn)確分期。 每位患者均簽署書面知情同意書，當(dāng)?shù)蒯t(yī)療道德委員會批準(zhǔn)了該研究方案。 [0035] 3.臨床組織樣本取樣 [0036] (1)準(zhǔn)備事項(xiàng)： [0037] 液氮罐(檢查液氮容積，事先及時(shí)充裝液氮)、冰盒、冰生理鹽水、無菌無酶凍存管(分裝好RNA保護(hù)液并編號備用)、消毒手套(不含滑石粉)、口罩、帽子、鑷子、剪刀、低溫記號筆等。 [0038] (2)操作流程： [0039] A.確定在患者術(shù)前已留取其血液樣本，并按照血液樣本提取流程處理，后將提取的血清移入Greiner凍存管中并以紅色低溫記號筆標(biāo)記編號，保存于低溫冰箱，并記錄于病例資料表及其電子版本中。 [0040] B.預(yù)先填寫組織標(biāo)本病例資料表(記錄有效的聯(lián)系方式以便于隨訪)，注意填寫內(nèi)容的完整性。預(yù)先確定留取癌與癌旁組織的凍存管的編號，并將其編號記錄于病例資料表中。 [0041] C.組織離體后立即置于彎盤中，迅速用冰鹽水沖淋(低溫可暫時(shí)抑制RNA酶活性以爭取取樣時(shí)間；洗滌組織樣本中混雜的血液，減少污染；維持組織樣本的滲透性以利于RNA保護(hù)液迅速滲透并發(fā)揮抑酶作用)。 [0042] D.選取胃粘膜組織并將其分解成約黃豆大小的小塊分裝，注意取樣順序：取2～4塊癌旁正常組織和2～4塊腫瘤組織，厚度不超過5mm,先取正常組織，再取腫瘤組織，一根凍存管僅適宜存放一塊樣本，勿混淆腫瘤與瘤旁正常組織的凍存管編號。 [0043] E.取樣完成后擰緊凍存管(如未旋緊瓶蓋液氮滲入凍存管中，常溫狀態(tài)下取出凍存管時(shí)易引發(fā)凍存管爆裂)，輕柔倒置并搖晃凍存管，使組織與保護(hù)液混勻，后迅速置于液氮罐中。 [0044] F.檢查組織標(biāo)本病例資料表填寫是否完善，在《冰箱標(biāo)本定位表》中預(yù)先確定并錄入樣本在深低溫冰箱中的存儲位置，及時(shí)將液氮罐中的樣本移入深低溫冰箱。避免因疏忽遺忘，導(dǎo)致液氮揮發(fā)殆盡后樣本浪費(fèi)不可用。 [0045] G.術(shù)后一周追蹤病理報(bào)告結(jié)果，并及時(shí)錄入病例資料表中，確定樣本是否能夠入組研究。 [0046] 4.RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR [0047] 通過使用TRIzol試劑提取組織中總RNA，并且根據(jù)制造商的說明書通過TIANamp?Virus?RNA試劑盒提取血漿中的總RNA。使用Prime-Script將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA?TM一步法RT-PCR試劑盒，甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內(nèi)部對照。使用引物對，上游引物:5′-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3′，核苷酸序列為SEQ? ID? NO.4。下游引物，5′-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’，核苷酸序列為SEQ?ID?NO.5。使用ABI7500系統(tǒng)和SYBR?Green?PCR?Master?Mix進(jìn)行所有qRT-PCR反應(yīng)。為了準(zhǔn)確驗(yàn)證GC組織中circ-CC2D1A表達(dá)的倍數(shù)變化，將計(jì)算的Ct值相對于從相同樣品擴(kuò)增的GAPDH(ΔCt＝Cttested-CtGAPDH)標(biāo)準(zhǔn)化，并且使用-ΔCt方法來估計(jì)變化的價(jià)值。每個(gè)樣本重復(fù)三次，所有反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)三次以確保所有數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。circ-EIF4G3的Cutoff值為-7.374，當(dāng)檢測出的-ΔCt大于這個(gè)值時(shí)為胃癌，其特異性為81.25％，敏感性為60.94％。 [0048] 實(shí)驗(yàn)操作步驟： [0049] (1)Trizol提取組織RNA： [0050] A.戴口罩及手套，打開4℃低溫離心機(jī)，設(shè)置好溫度備用。計(jì)算所需提取的樣本數(shù)，準(zhǔn)備雙份數(shù)量的1.5ml無菌無酶EP管，置于EP管架上備用。 [0051] B.研磨器皿中倒入適量液氮預(yù)冷，取50-100mg組織置入液氮中，研磨組織至粉末狀。 [0052] C.加入1ml?Trizol到研磨器皿中，繼續(xù)研磨凝固狀的組織與Trizol的混合物。 [0053] D.靜置待其液化，轉(zhuǎn)移至Rnase?free?1.5ml?EP管中。