一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用
地域：
江蘇省
江蘇省南京市
摘要
本發(fā)明公開了一種新的胃癌標志物circ?EIF4G3的應用，涉及circ?EIF4G3分子標志物的檢測、應用，設計并合成出特異性用于實時定量PCR的檢測引物。針對目標人群對胃癌內鏡篩查依從性差，以及臨床上確診的胃癌患者絕大多數(shù)都是中晚期的現(xiàn)狀提出，在胃癌癌變進程中找到理想的分子預警信號，有針對性的進行內鏡檢查，病理確診，以減輕病人痛苦，避免過度醫(yī)療，節(jié)省醫(yī)療資源。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)circ?EIF4G3分子標志物可作為胃癌患者檢測和監(jiān)測預后的標志物。
說明書
[0054] E.室溫下靜置5min,每1ml?Trizol加入200ul氯仿。
[0055] F.劇烈震蕩15s，室溫下靜置2-3min。
[0056] G.4℃，12000g-14000g，離心15min。
[0057] H.轉移水相至新的Rnase?free?1.5ml?EP中，每1ml?Trizol加入500ul異丙醇，室溫放置10min。
[0058] I.4℃，12000g，離心10min。預配清洗RNA的75％乙醇(需用DEPC水配制)。
[0059] J.小心棄去上清，每管加入至少1ml?75％乙醇洗滌RNA沉淀，渦旋混合。
[0060] K.4℃，7500-10000g，離心5-10min。小心棄去上清。
[0061] L.風干RNA沉淀(風干后RNA為無色)，使用DEPC-水溶解沉淀(依據(jù)沉淀大小加入
10-80ul左右)，用槍頭吸打吹勻。
[0062] (2)Trizol提取細胞RNA：
[0063] A.待提取細胞用PBS清洗兩遍。
[0064] B.加入適量Trizol到培養(yǎng)器皿中(小瓶/六孔板每孔1ml,大皿3ml,大瓶5ml)。
[0065] C.反復吹打幾次，轉移至Rnase?free?1.5ml?EP管中。
[0066] D.室溫下靜置5min,每1ml?Trizol加入200ul氯仿。
[0067] E.劇烈晃動15s，室溫下靜置2-3min。
[0068] F.4℃，12000-14000g，離心15min。
[0069] G.轉移水相至新的Rnase?free?1.5ml?EP中，每1ml?Trizol加入500ul異丙醇，室溫放置10min。
[0070] H.4℃，12000g，離心10min。
[0071] I.棄去上清，加入至少1ml?75％乙醇洗滌RNA沉淀，渦旋混合。
[0072] J.4℃，7500-10000g，離心5-10min。
[0073] K.風干RNA沉淀，使用DEPC-水溶解沉淀(依據(jù)沉淀大小加入10-80ul左右)。
[0074] (3)檢測所提取的樣本RNA濃度：
[0075] A.按照1％濃度在新的Rnase?free200ul?EP管中配置每個待測樣本(每個待檢測樣本1ul+99ulDEPC水)。
[0076] B.打開紫外分光光度計，清洗比色皿，取100ulDEPC水設置空白對照。
[0077] C.依次注入待測樣本檢測并記錄樣本濃度、OD260/280比值。
[0078] (4)RNA逆轉錄：
[0079] A.從-20℃冰箱中取出逆轉錄試劑盒，將2種酶插入冰盒冰中，其它試劑冰上融化，RNase?Free水常溫融化備用。
[0080] B.根據(jù)所測RNA濃度，計算逆轉錄每管所需RNA體積，并同時計算出DEPC水體積。
[0081] C.取PCR管架置于冰上，按需要放入無菌無酶200ul?PCR管并按編號標記。移液器吸取適量RNA后，將槍頭垂直插入PCR管底，勻速輕柔打出液體。
[0082] D.移液器吸取適量DEPC水，槍頭貼著后壁打入PCR管內。
[0083] E.逆轉錄Step1：每管加入gDNA?Eraser?1ul及5x?gDNA?Eraser?Buffer?2ul。
[0084] F.置于八聯(lián)管離心機上，輕輕彈掉管底或管壁氣泡，短時離心。
[0085] G.RT-PCR儀上42℃2分鐘,反應后產(chǎn)物置于冰上備用。
[0086] H.逆轉錄Step2：取1.5ml?EP管，按照以下配方，配置每管反應Mix[0087]
[0088]
[0089] 設定反應條件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃維持。
[0090] I.扣緊管蓋，將其從管架上取下來，置于離心管架上，有氣泡者可輕彈管底，短時離
[0091] 心，確認每管的液平一致且管內無氣泡后，復置于冰上。
[0092] J.設置反應條件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃維持。上機操作，15-20min后將cDNA置于-20℃保存。
[0093] (5)qRT-PCR步驟：
[0094] A.準備好冰盒，從-20℃冰箱中取出待測樣本的cDNA、引物、PCR試劑，冰上解凍。
[0095] B.備好八聯(lián)管及管蓋、八聯(lián)管架、鑷子、無菌1.5ml?EP管、EP管架、適宜量程的移液器、無菌薄膜手套。
[0096] C.將解凍好的cDNA、引物、PCR試劑先依次短時振蕩離心，冰上靜置備用。
[0097] D.依據(jù)檢測樣本及指標數(shù)量，劃分不同目的基因加樣區(qū)域。將八聯(lián)管架置于冰上，用鑷子夾取八聯(lián)管并將其鋪置于八聯(lián)管架上。
[0098] E.取1.5ml?EP管，按以下每孔19ul配制八聯(lián)管PCR?Mix，并震蕩離心。
[0099] F.按預設好每個樣本及復孔在八聯(lián)管的位置，依次加入樣本的1ul?cDNA及19ul?PCR?Mix。
權利要求
1.一種檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，所述circ-EIF4G3標志物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。
2.如權利要求1所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑為實時定量PCR試劑。
3.如權利要求1或2所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑包括
1對用于檢測SEQ?ID?NO.1?的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5所示。
4.如權利要求1所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑包括檢測circ-EIF4G3標志物的引物和/或探針。
2.如權利要求1所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑為實時定量PCR試劑。
3.如權利要求1或2所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑包括
1對用于檢測SEQ?ID?NO.1?的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5所示。
4.如權利要求1所述的檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑在制備胃癌診斷試劑中的應用，其特征在于：所述檢測血液中circ-EIF4G3標志物表達水平的試劑包括檢測circ-EIF4G3標志物的引物和/或探針。
意見反饋