[0069] 實(shí)施例5:取1g脫乙酰殼多糖衍生物溶于100mL?水中,作為溶液A;取1g重組Ⅲ型人源化膠原蛋白溶于100mL水中,作為溶液B;室溫下,在200rpm攪拌下,將溶液B加入溶液A中,制備脫乙酰殼多糖/蛋白復(fù)合物;所得復(fù)合物經(jīng)過高溫滅菌后,可直接作為功效物用于護(hù)膚品中。
[0070] 通過動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)發(fā)現(xiàn),本實(shí)施例中制備的脫乙酰殼多糖/蛋白復(fù)合物中,脫乙酰殼多糖衍生物和纖連蛋白形成的納米顆粒大小和Zeta電 勢(shì)見表1。
實(shí)施例6:1.將透明質(zhì)酸鈉0.1g,甘油50g,Sepimax?Zen?0.5g,卡波姆?0.5g,霍霍巴蠟?PEG?120?酯類?4g,PEG?20?甲基葡糖倍半硬脂酸酯?4g,對(duì)羥基苯乙酮?2g,去離子水
923.9g?,加熱至85℃,混合均質(zhì)后,制得混合物;
[0071] 2.溫度降至45℃后,向上述溶液中加入實(shí)施例2、3、4或5制備的脫乙酰殼多糖/蛋白復(fù)合物,攪拌使其充分溶解;
[0072] 3.再向上述溶液中加入1.2?戊二醇?10g,充分?jǐn)嚢?,得精華液a,降至室溫,出料、靜置。
[0073] 應(yīng)用例1:1、測(cè)試樣品制備
[0074] 配制含1%?CSNPs(實(shí)施例1制備的脫乙酰殼多糖衍生物)的5mL水溶液A。
[0075] 取1g?重組Ⅲ型人源化膠原蛋白溶于?pH5.5?(0.1M?PBS)中,室溫下,向其中加入
0.05g熒光素,反應(yīng)12小時(shí)后,使用透析方法(MW=300Da)除掉未反應(yīng)的熒光素;得熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白。經(jīng)冷凍干燥后,得成品熒光素標(biāo)記的III型類人源蛋白。
[0076] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白蛋白溶于5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的III型類人源膠原蛋白產(chǎn)品B。
[0077] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白溶于含有1%?CSNPs(實(shí)施例
1制備的脫乙酰殼多糖衍生物)的5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白產(chǎn)品C。
[0078] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白溶于含有1%CMCS(羧甲基殼多糖)的5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白產(chǎn)品D。
[0079] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白溶于含有1%HPCS(羥丙基殼多糖)的5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白產(chǎn)品E。
[0080] 2、透皮實(shí)驗(yàn):將60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為六組,每組10只,即對(duì)照組,A,B,C,D,E每只小鼠用電動(dòng)剃須刀去掉2塊5*5cm的毛,露出皮膚,然后在上述脫毛的2塊皮膚上分別涂抹0.5mL制備的空白溶液(超純水,對(duì)照),A,B,C,D,E。經(jīng)八小時(shí)后,麻醉處死小鼠后,取涂抹空白溶液(超純水,對(duì)照),A,B,C,D,E的皮膚,常規(guī)制備石蠟切片,進(jìn)行熒光成像,如圖4所示。
[0081] 3、熒光定量統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。冷凍切片直接免疫熒光染色方法的判讀結(jié)果比較采用x2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如圖5所示。需要說明的是,圖5中,CSNPs表示A中的脫乙酰殼多糖衍生物的吸收量;III?Collagen表示B中的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的吸收量;III?Collagen@CSNPs?表示C中的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的吸收量;?III?Collagen@CMCS表示D中的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的吸收量;?III?Collagen@HPCS表示E中的重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的吸收量。
[0082] 4、結(jié)果
[0083] 從圖5可以得出,與重組Ⅲ型人源化膠原蛋白相比,本發(fā)明的脫乙酰殼多糖衍生物可以顯著地促進(jìn)重組Ⅲ型人源化膠原蛋白的經(jīng)皮吸收,兩小時(shí)時(shí)是單體的1.5倍;四小時(shí)后吸收量是單體的4倍。同樣,與羧甲基殼多糖和羥丙基殼多糖相比,其吸收量也有4倍以上的增加。
[0084] 應(yīng)用例2:1、樣品制備:配制含1%?CSNPs(實(shí)施例1制備的脫乙酰殼多糖衍生物)的
5mL水溶液A(CS)。
[0085] 取1g?纖連蛋白溶于?pH5.5?(0.1M?PBS)中,室溫下,向其中加入0.05g熒光素,反應(yīng)12小時(shí)后,使用透析方法(MW=300Da)除掉未反應(yīng)的熒光素;得熒光素標(biāo)記的纖連蛋白。經(jīng)冷凍干燥后,得成品熒光素標(biāo)記的纖連蛋白。
[0086] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的纖連蛋白溶于5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的纖連蛋白B(FN)。
[0087] 取0.1g制備的熒光素標(biāo)記的纖連蛋白溶于含有1%?CSNPs(實(shí)施例1制備的脫乙酰殼多糖衍生物)的5mL水溶液中,得熒光素標(biāo)記的纖連蛋白產(chǎn)品C(CS@FN)。