一種卵巢細胞冷凍液和解凍液及其制備方法 技術領域 [0001] 本發(fā)明涉及生物材料技術領域，尤其涉及一種卵巢細胞冷凍液和解凍液及其制備方法。 背景技術 [0002] 卵巢細胞在冷凍的過程中，由于其具有大的尺寸繼而具有大量的水分，卵巢細胞可能會受到損壞，進而降低其低溫凍存存活率。另外卵巢細胞組成復雜，各部分的熱導率和熱容不均勻，很難在解凍過程中實現(xiàn)均勻傳熱，解凍過程的冰晶重結(jié)晶后會對細胞造成很大的損傷。 [0003] 卵巢細胞在冷凍和解凍過程中，選擇合適的冷凍保護劑能減弱冰晶和高濃度溶質(zhì)對卵巢細胞的損害，提高卵子存活率，現(xiàn)有技術中的卵巢冷凍采用的冷凍保護劑大多含有血清、二甲基亞砜DMSO或兩者的組合等，這些冷凍保護劑可使溶液冰點降低，進而提高細胞膜對水的通透性，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而避免卵巢細胞的損傷。 [0004] 其中，DMSO能夠快速穿透卵巢細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時減少卵巢細胞內(nèi)冰晶的形成，從而避免卵巢細胞損傷，但DMSO對細胞存在一定的毒性，不使用DMSO，尋找其他替代物也顯得尤為必要。 [0005] 冷凍保護劑成分通常還包含血清，然而即使是純化的白蛋白，由于其動物來源的特性，仍然會極大增加帶來病毒等感染物質(zhì)的可能，同時血清來源受限，價格昂貴，所以其使用也必然會受到越來越多的限制。因此，尋找替代血清的非滲透性保護劑顯得尤為必要。 [0006] 現(xiàn)有技術的冷凍液中一般單獨使用血清或者DMSO，或者使用少量的DMSO，但是同時不含有血清和DMSO的冷凍液，且能達到類似或更高存活率效果的冷凍液卻非常少見。 發(fā)明內(nèi)容 [0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種卵巢細胞冷凍液和解凍液及其制備方法，通過不使用DMSO和血清制備冷凍液和解凍液，解決了現(xiàn)有技術中由于使用DMSO或血清，導致可能的病毒污染以及增加對卵巢細胞潛在的毒性作用風險的問題。 [0008] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案： [0009] 本發(fā)明第一方面提供了一種卵巢細胞冷凍液和解凍液的制備方法，所述冷凍液和解凍液的制備步驟包括： [0010] （1）將0.5g～8g?聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加熱，并磁力攪拌下加入到30～ 40ml緩沖液中，冷卻至室溫后得到第一溶液； [0011] （2）將2?g～5g全甲基化環(huán)糊精超聲溶解于20m～30ml的緩沖液中，待所述全甲基化環(huán)糊精全部溶解后，加入0.05?g～0.2g金納米籠，超聲振蕩后，得到第二溶液； [0012] （3）將第一溶液和第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后調(diào)節(jié)pH值至7，并定容補足余量緩沖液至100ml，得到冷凍液； [0013] （4）將0.5?g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加熱，并磁力攪拌下加入到20～ 40ml緩沖液中，冷卻至室溫后加入0.05?g～0.2g金納米籠，超聲振蕩后，然后調(diào)節(jié)pH值至7，并定容補足余量緩沖液至100ml，得到解凍液。 [0014] 根據(jù)本公開的至少一個實施方式，所述全甲基化環(huán)糊精為α?全甲基化環(huán)糊精、β?全甲基化環(huán)糊精或γ?全甲基化環(huán)糊精中的一種，所述全甲基化環(huán)糊精具有直徑為0.5nm～ 1.5nm且高度為3?nm～4nm的孔洞。 [0015] 根據(jù)本公開的至少一個實施方式，所述金納米籠為立方體納米顆粒，所述立方體納米顆粒的表面帶有孔洞，所述金納米籠的粒徑為20?nm～80nm，優(yōu)選為30?nm～60nm，更優(yōu)選為40?nm～50nm。 [0016] 根據(jù)本公開的至少一個實施方式，所述聚乙烯醇的分子量為550?kDa～650kDa。 [0017] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明實施例提供的卵巢細胞冷凍液和解凍液的制備方法，通過將0.5g～8g聚乙烯醇溶解到緩沖液中得到第一溶液，而將2?g～5g全甲基化環(huán)糊精、0.05?g～0.2g的金納米籠加入到緩沖液中形成第二溶液，然后將第一溶液和第二溶液混合后再加入5ml～8ml的乙二醇調(diào)節(jié)PH值至7從而得到無DMSO或血清的冷凍液。其中，金納米籠懸浮于冷凍液中，不與冷凍液中的其他成分發(fā)生化學反應，無毒副作用，也不會進入卵巢細胞內(nèi)部，且金納米籠可有效抑制冰的重結(jié)晶，能夠提高細胞低溫凍存的存活率。另外，全甲基化環(huán)糊精和金納米籠均能提高卵巢細胞存活率，且兩者共同使用可以起到協(xié)同作用，在冷凍液中同時加入上述兩種物質(zhì)進而避免使用DMSO和血清，降低了其毒性以及易帶入寄生性生物污染物的風險。 [0018] 本發(fā)明實施例解凍液也能夠避免使用DMSO和血清，將聚乙烯醇加入緩沖液后再加入金納米籠然后調(diào)節(jié)PH值至中性，也具有抑制冰晶生長的作用。綜上，本發(fā)明實施例的冷凍液和解凍液能有效控制冰晶生長，顯著改善解凍過程中對卵巢細胞的損害，能達到或優(yōu)于現(xiàn)有的冷凍解凍液的存活率，且生物相容性好。

1.一種卵巢細胞冷凍液和解凍液的制備方法，其特征在于，所述冷凍液和解凍液的制備步驟包括： （1）將0.5g～5g?聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加熱，并磁力攪拌下加入到20～40ml緩沖液中，冷卻至室溫后得到第一溶液； （2）將2g～5g全甲基化環(huán)糊精超聲溶解于20ml～30ml的緩沖液中，待所述全甲基化環(huán)糊精全部溶解后，加入0.05?g～0.2g金納米籠，超聲振蕩后，得到第二溶液； （3）將第一溶液和第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后調(diào)節(jié)pH值至7，并定容補足余量緩沖液至100ml，得到冷凍液； （4）?將0.5?g～5g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加熱，并磁力攪拌下加入到20～ 40ml緩沖液中，冷卻至室溫后加入0.05?g～0.2g金納米籠，超聲振蕩后，調(diào)節(jié)pH值至7，并定容補足余量緩沖液至100ml，得到解凍液； 所述緩沖液為PBS緩沖液；所述全甲基化環(huán)糊精為α?全甲基化環(huán)糊精、β?全甲基化環(huán)糊精或γ?全甲基化環(huán)糊精中的一種或多種，所述全甲基化環(huán)糊精具有直徑為0.5nm～1.5nm且高度為3?nm～4nm的孔洞；所述金納米籠為立方體納米顆粒，所述立方體納米顆粒的表面帶有孔洞，所述金納米籠的粒徑為20?nm～80nm。 2.?根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量為550?kDa～ 650kDa。 3.?一種卵巢細胞冷凍液和解凍液，其特征在于，根據(jù)權利要求1?2任一項所述的制備方法制備而得，其中，每100ml冷凍液中包括0.5?g～5g的聚乙烯醇、2?g～5g全甲基化環(huán)糊精、0.05?g～0.2g金納米籠、5ml～8ml的乙二醇，余量為PBS緩沖液； 每100ml解凍液中包括0.5?g～5g的聚乙烯醇、0.05?g～0.2g金納米籠，余量為PBS緩沖液。 4.一種激光加溫解凍的方法，其特征在于，采用權利要求1?2任一項所述的制備方法制備的冷凍液和解凍液，對所述冷凍液冷凍的卵巢細胞進行解凍復溫，同時通過近紅外激光進行照射，之后轉(zhuǎn)移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢細胞的解凍。 5.根據(jù)權利要求4所述的激光加溫解凍的方法，其特征在于，在對所述冷凍液冷凍的卵巢細胞進行解凍復溫，同時通過近紅外激光進行照射的步驟中，解凍復溫的時間為10s～ 13s。