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一種西番蓮PeHSF1基因在負調(diào)控西番蓮抗旱和耐鹽性的應(yīng)用

專利號
CN119320784B
公開日期
2025-02-28
申請人
中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院; 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所(海南省三亞市崖州區(qū)創(chuàng)意產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)廠房二期三樓235區(qū))
發(fā)明人
許奕; 宋順; 邢文婷; 黃東梅; 馬伏寧; 吳斌; 楊雙鈺; 李洪立; 胡文斌
IPC分類
C12N15/29; C07K14/415; C12N15/82; C12N15/81; C12N1/19; A01H5/00; A01H6/20; C12N15/11; C12R1/865
技術(shù)領(lǐng)域
西番蓮,基因,脅迫,轉(zhuǎn)基因,干旱,載體,酵母,方面,培養(yǎng),pcr
地域: 海南省 海南省三亞市

摘要

本發(fā)明提供了一種西番蓮PeHSF1基因,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明提供了首次從西番蓮中克隆獲得西番蓮PeHSF1基因,研究顯示該基因還能夠明顯降低酵母在干旱脅迫和高鹽脅迫下的生存能力,在抗干旱脅迫和高鹽脅迫下,轉(zhuǎn)PeHSF1基因植物發(fā)芽率顯著降低,說明PeHSF1基因能夠明顯降低植物抗干旱脅迫和高鹽脅迫的能力,而且能夠抑制植物生長,使植物生長緩慢等。本發(fā)明為研究酵母和植物抗逆性、調(diào)控植物生長等方面的研究提供新的候選基因。

說明書

1 2 3
[0020] 本發(fā)明提供了首次從西番蓮中克隆獲得西番蓮PeHSF1基因,將其轉(zhuǎn)化擬南芥,結(jié)果表明,與野生型對比,PeHSF1轉(zhuǎn)基因擬南芥生長較慢,比同期轉(zhuǎn)基因擬南芥小,同時,在模擬干旱和高鹽脅迫的生長條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率要低于野生型。說明PeHSF1基因能夠明顯降低植物抗干旱脅迫和高鹽脅迫的能力,而且能夠抑制植物生長,使植物生長緩慢等。將其轉(zhuǎn)化酵母,研究顯示PeHSF1抑制了酵母的生長,能夠明顯降低酵母在干旱脅迫和高鹽脅迫下的生存能力。綜合以上結(jié)果表明,PeHSF1可能在非生物脅迫中起著負調(diào)控的作用,本發(fā)明為研究酵母和植物抗逆性、調(diào)控植物生長等方面的研究提供新的候選基因,為西番蓮PeHSF1基因在非生物脅迫以及植株發(fā)育調(diào)控功能上奠定了基礎(chǔ)。 附圖說明 [0021] 圖1為轉(zhuǎn)PeHSF1基因擬南芥正常生長(對照)、干旱脅迫、高鹽脅迫的表型,其中L1和L2為轉(zhuǎn)PeHSF1基因擬南芥。 [0022] 圖2為干旱脅迫下PeHSF?1轉(zhuǎn)基因酵母的生長情況。 [0023] 圖3為高鹽脅迫下PeHSF?1轉(zhuǎn)基因酵母的生長情況。 具體實施方式 [0024] 下面參照附圖,結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明,以更好地理解本發(fā)明。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。 [0025] 實施例1:西番蓮PeHSF1基因的克隆 [0026] 提取紫果西番蓮幼苗中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板,采用表2所示PCR引物,進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系如表1所示PCR擴增程序為:95?℃預(yù)變性? 3?min,95℃?40?s,72℃?5min,35個循環(huán),72℃失活?10?min,?退火溫度、時間及各基因引物如表2所示?;厥諗U增產(chǎn)物,測序,獲得西番蓮PeHSF1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。 [0027] 表1?PeHSF?1?PCR反應(yīng)體系 [0028] 各組分名稱 使用量 cDNA 1μl Primer?F 1μl Primer?R 1μl 2×FastTaq Premix 12.5μl H2O 9.5μl Total volume 25μl [0029] 表2?PeHSF?1全長引物及PCR擴增程序 [0030] [0031] 將獲得的pCAMBIA1304?PeHSF?1表達載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中,將農(nóng)桿菌涂布于添加卡那和利福平抗生素的固體YEP培養(yǎng)基中,待長出菌落后進行PCR鑒定,將PCR陽性的菌落搖菌保存,用于后續(xù)植物侵染。 [0032] 實施例2:PeHSF1基因?qū)χ参锏挠绊? [0033] 轉(zhuǎn)PeHSF?1基因陽性農(nóng)桿菌 [0034] ?提取紫果西番蓮幼苗中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板,以CCATGGATGAACCCCGAAGACAATAAG和ACTAGTTATATTCTTGGACGAAT為引物,進行PCR擴增反應(yīng),反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參見實施例1,得到帶有NcoI和SpeI酶切位點的PeHSF?1全長序列。將pCAMBIA1304空載體和添加了酶切位點的PeHSF?1全長序列用NcoI和SpeI雙酶切,再將兩個片段進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),涂布于LB固體培養(yǎng)基中,待長出單菌落后進行陽性PCR檢測,獲得pCAMBIA1304?PeHSF?1表達載體。 [0035] 2、轉(zhuǎn)基因擬南芥 [0036] 以蛭石為基質(zhì),溫度控制在21?23℃,營養(yǎng)生長期每日光照時間為8h,生殖生長期每日為光照16h,光照強度為2000lx,培養(yǎng)室相對濕度為70%?90%種植擬南芥。當(dāng)幼苗長出真葉后,可進行移植,培養(yǎng)至幼苗長出新葉,花苔長至5?10cm,側(cè)苔抽出,擬南芥花朵未完全展開時用于轉(zhuǎn)化。 [0037] 將轉(zhuǎn)PeHSF?1基因陽性農(nóng)桿菌菌液利用YEB培養(yǎng)基擴繁搖菌至OD600≈1,離心機 5000rpm離心菌液10min后棄上清液加入50g/L白糖水重懸至OD≈0.8將步驟1中擬南芥花序完全浸入白糖水重懸的菌液中,沾花時間1min,用保鮮膜將侵染后的擬南芥花序包裹住放置0光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后正常光照培養(yǎng),待長出果莢后收獲擬南芥T0代種子。 [0038] 將浸染后的擬南芥正常培養(yǎng)直至獲得種子,將種子置于75%酒精+2.5%?吐溫100中浸泡1min,重復(fù)三次,無菌水清洗一次,徹底滅菌后播種于帶有潮霉素?(25μg/ml)的MS固體培養(yǎng)基中,4℃冰箱春化三天后正常培養(yǎng)獲得陽性植株。該種植及播種流程重復(fù)三次直至獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥。 [0039] 3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型以及抗旱性和耐鹽性檢測

權(quán)利要求

1.一種西番蓮PeHSF1基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
2.如權(quán)利要求1所述西番蓮PeHSF1基因編碼的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求1所述西番蓮PeHSF1基因編碼區(qū)的重組載體或宿主菌或表達盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于,所述重組載體的原始載體為pCAMBIA1304表達載體,西番蓮PeHSF1基因編碼區(qū)位于pCAMBIA1304表達載體的NcoI和SpeI兩限制性內(nèi)切酶位點之間。
5.如權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于,所述重組載體的原始載體為pYES?2表達載體,西番蓮PeHSF1基因編碼區(qū)位于pYES?2表達載體的HinIII和BamHI兩限制性內(nèi)切酶位點之間。
6.如權(quán)利要求1所述的西番蓮PeHSF1基因、或者如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)、或者如權(quán)利要求3所述的重組載體或宿主菌或表達盒在降低酵母抗旱性和/或抗鹽性中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1所述的西番蓮PeHSF1基因、或者如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)、或者如權(quán)利要求3所述的重組載體或宿主菌或表達盒在使植物生長緩慢中的應(yīng)用,所述的植物是擬南芥。
8.如權(quán)利要求1所述的西番蓮PeHSF1基因、或者如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)、或者如權(quán)利要求3所述的重組載體或宿主菌或表達盒在降低植物抗旱性和/或抗鹽性中的應(yīng)用,所述的植物是擬南芥。
9.如權(quán)利要求1所述的西番蓮PeHSF1基因、或者如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)、或者如權(quán)利要求3所述的重組載體或宿主菌或表達盒在干旱脅迫和/或高鹽脅迫下降低植物發(fā)芽率中的應(yīng)用,所述的植物是擬南芥。
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