[0020] 本發(fā)明提供了首次從西番蓮中克隆獲得西番蓮PeHSF1基因,將其轉(zhuǎn)化擬南芥,結(jié)果表明,與野生型對比,PeHSF1轉(zhuǎn)基因擬南芥生長較慢,比同期轉(zhuǎn)基因擬南芥小,同時,在模擬干旱和高鹽脅迫的生長條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率要低于野生型。說明PeHSF1基因能夠明顯降低植物抗干旱脅迫和高鹽脅迫的能力,而且能夠抑制植物生長,使植物生長緩慢等。將其轉(zhuǎn)化酵母,研究顯示PeHSF1抑制了酵母的生長,能夠明顯降低酵母在干旱脅迫和高鹽脅迫下的生存能力。綜合以上結(jié)果表明,PeHSF1可能在非生物脅迫中起著負調(diào)控的作用,本發(fā)明為研究酵母和植物抗逆性、調(diào)控植物生長等方面的研究提供新的候選基因,為西番蓮PeHSF1基因在非生物脅迫以及植株發(fā)育調(diào)控功能上奠定了基礎(chǔ)。
附圖說明
[0021] 圖1為轉(zhuǎn)PeHSF1基因擬南芥正常生長(對照)、干旱脅迫、高鹽脅迫的表型,其中L1和L2為轉(zhuǎn)PeHSF1基因擬南芥。
[0022] 圖2為干旱脅迫下PeHSF?1轉(zhuǎn)基因酵母的生長情況。
[0023] 圖3為高鹽脅迫下PeHSF?1轉(zhuǎn)基因酵母的生長情況。
具體實施方式
[0024] 下面參照附圖,結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明,以更好地理解本發(fā)明。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0025] 實施例1:西番蓮PeHSF1基因的克隆
[0026] 提取紫果西番蓮幼苗中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板,采用表2所示PCR引物,進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系如表1所示PCR擴增程序為:95?℃預(yù)變性?
3?min,95℃?40?s,72℃?5min,35個循環(huán),72℃失活?10?min,?退火溫度、時間及各基因引物如表2所示?;厥諗U增產(chǎn)物,測序,獲得西番蓮PeHSF1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
[0027] 表1?PeHSF?1?PCR反應(yīng)體系
[0028]
各組分名稱 使用量
cDNA 1μl
Primer?F 1μl
Primer?R 1μl
2×FastTaq Premix 12.5μl
H2O 9.5μl
Total volume 25μl
[0029] 表2?PeHSF?1全長引物及PCR擴增程序
[0030]
[0031] 將獲得的pCAMBIA1304?PeHSF?1表達載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中,將農(nóng)桿菌涂布于添加卡那和利福平抗生素的固體YEP培養(yǎng)基中,待長出菌落后進行PCR鑒定,將PCR陽性的菌落搖菌保存,用于后續(xù)植物侵染。
[0032] 實施例2:PeHSF1基因?qū)χ参锏挠绊?
[0033] 轉(zhuǎn)PeHSF?1基因陽性農(nóng)桿菌
[0034] ?提取紫果西番蓮幼苗中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板,以CCATGGATGAACCCCGAAGACAATAAG和ACTAGTTATATTCTTGGACGAAT為引物,進行PCR擴增反應(yīng),反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參見實施例1,得到帶有NcoI和SpeI酶切位點的PeHSF?1全長序列。將pCAMBIA1304空載體和添加了酶切位點的PeHSF?1全長序列用NcoI和SpeI雙酶切,再將兩個片段進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),涂布于LB固體培養(yǎng)基中,待長出單菌落后進行陽性PCR檢測,獲得pCAMBIA1304?PeHSF?1表達載體。
[0035] 2、轉(zhuǎn)基因擬南芥
[0036] 以蛭石為基質(zhì),溫度控制在21?23℃,營養(yǎng)生長期每日光照時間為8h,生殖生長期每日為光照16h,光照強度為2000lx,培養(yǎng)室相對濕度為70%?90%種植擬南芥。當(dāng)幼苗長出真葉后,可進行移植,培養(yǎng)至幼苗長出新葉,花苔長至5?10cm,側(cè)苔抽出,擬南芥花朵未完全展開時用于轉(zhuǎn)化。
[0037] 將轉(zhuǎn)PeHSF?1基因陽性農(nóng)桿菌菌液利用YEB培養(yǎng)基擴繁搖菌至OD600≈1,離心機
5000rpm離心菌液10min后棄上清液加入50g/L白糖水重懸至OD≈0.8將步驟1中擬南芥花序完全浸入白糖水重懸的菌液中,沾花時間1min,用保鮮膜將侵染后的擬南芥花序包裹住放置0光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后正常光照培養(yǎng),待長出果莢后收獲擬南芥T0代種子。
[0038] 將浸染后的擬南芥正常培養(yǎng)直至獲得種子,將種子置于75%酒精+2.5%?吐溫100中浸泡1min,重復(fù)三次,無菌水清洗一次,徹底滅菌后播種于帶有潮霉素?(25μg/ml)的MS固體培養(yǎng)基中,4℃冰箱春化三天后正常培養(yǎng)獲得陽性植株。該種植及播種流程重復(fù)三次直至獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
[0039] 3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型以及抗旱性和耐鹽性檢測