一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及編碼基因和催化Reb?D的用途 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明屬于生物酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及編碼基因和催化Reb?D的用途。 背景技術(shù) [0002] 甜菊糖苷(Stevia)又稱作甜菊糖(Steviasugar)，是一種從植物甜菊葉片中提取獲得的新型甜味劑。由于甜菊糖苷不產(chǎn)生熱量，也不增加血糖水平，且甜度比蔗糖高出300倍，已作為非營養(yǎng)性甜味劑在某些國家被用于甜味食品幾百年。萊鮑迪苷A (RebaudiosideA，RebA)是其中主要的甜菊糖苷，為蔗糖甜度的300倍。然而，RebA的苦澀味影響口感，且價(jià)格略低于萊鮑迪苷D（RebaudiosideD，RebD）。 [0003] 然而，由于在RebD在甜葉菊中含量很低，所以通過植物提取純化的方式成本巨大，且產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足市場需求。因此不能采用直接從植物中提取的方式生產(chǎn)RebD，只能進(jìn)行人工合成，而人工合成RebD需要進(jìn)行糖基化反應(yīng)，方式有兩種：化學(xué)合成和酶法合成。 化學(xué)糖基化通常需要繁瑣的保護(hù)和脫保護(hù)步驟，并且具有較低的特異性和產(chǎn)率。而酶促糖基化表現(xiàn)出高效、立體和區(qū)域特異性，可以直接快速地產(chǎn)生糖苷鍵，且對環(huán)境友好。到目前為止，已有許多來源不同的糖基轉(zhuǎn)移酶被鑒定出具有催化合成RebD的活性，但這些糖基轉(zhuǎn)移酶普遍存在活力低下，無法耐受高底物濃度的問題。且部分酶存在副反應(yīng)，會產(chǎn)生RebD的同系物，增加下游純化的壓力。 發(fā)明內(nèi)容 [0004] 本發(fā)明提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及編碼基因和催化Reb?D的用途，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體可利用低價(jià)值的Reb?A高效催化合成高價(jià)值的Reb?D。 [0005] 本發(fā)明提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，包括對糖基轉(zhuǎn)移酶UGT1的氨基酸序列進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)突變； [0006] 所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。 [0007] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，包括對SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的第147位、第206位、第209位和第268位進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)突變。 [0008] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述單點(diǎn)或多點(diǎn)突變包括以下任意一種或多種的組合：將SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的第147位谷氨酰胺突變?yōu)楫惲涟彼?、?06位谷氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?09位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼岷偷?68位苷氨酸突變?yōu)榈鞍彼帷? [0009] 本發(fā)明還提供了編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因。 [0010] 本發(fā)明還提供了擴(kuò)增得到上述基因的引物對。 [0011] 本發(fā)明還提供了包含上述基因并表達(dá)上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的重組載體。 [0012] 本發(fā)明還提供了包含上述重組載體并表達(dá)上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的重組細(xì)胞。 [0013] 本發(fā)明還提供了上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體或利用上所述重組細(xì)胞生產(chǎn)的重組糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在催化Reb?A生物合成Reb?D中的應(yīng)用。 [0014] 本發(fā)明還提供了一種催化Reb?A生物合成Reb?D的方法，包括以Reb?A為底物，以UDPG為葡萄糖供體，利用上所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體或利用上述重組細(xì)胞生產(chǎn)的重組糖基轉(zhuǎn)移酶突變體進(jìn)行酶促反應(yīng)，生物合成Reb?D。 [0015] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述酶促反應(yīng)的溫度為40℃，時(shí)間為12h。 [0016] 有益效果：本發(fā)明挖掘得到一種具有催化萊鮑迪苷A合成萊鮑迪苷D活性的糖基轉(zhuǎn)移酶PmUGT1（WP_192997595.1），所述糖基轉(zhuǎn)移酶PmUGT1來源于細(xì)菌Priestia?megaterium，相比于植物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶，如EUGT11和UGTSL2，可以在大腸桿菌BL21（DE3）中功能表達(dá)，具有優(yōu)異的溶解度，并且可以催化Reb?A生物合成Reb?D，同時(shí)具有很高的區(qū)域選擇性。 因此，本發(fā)明提供一種能夠高效催化Reb?A生物合成Reb?D的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體是在PmUGT1的氨基酸序列的第147位（谷氨酰胺Q）、第206位（谷氨酸E）、第209位（苯丙氨酸F）、第268位（苷氨酸G）進(jìn)行單點(diǎn)及多點(diǎn)突變，與野生型UGT1相比，催化活性最高可提高9.27倍。 附圖說明 [0017] 圖1為重組質(zhì)粒pET24a?PmUGT的質(zhì)粒圖譜； [0018] 圖2為質(zhì)粒酶切片段電泳圖； [0019] 圖3為萊鮑迪苷D（RD）標(biāo)準(zhǔn)品液相圖； [0020] 圖4為轉(zhuǎn)化液液體圖譜。 具體實(shí)施方式 [0021] 本發(fā)明提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，包括對糖基轉(zhuǎn)移酶UGT1的氨基酸序列進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)突變；