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一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法

閱讀：780發(fā)布：2023-03-04

專利匯可以提供一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法專利檢索，專利查詢，專利分析的服務。并且本 發(fā)明 公開了一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法：對以綠色 熒光 蛋白(GFP)作為報告蛋白的細胞進行BrdU摻入 染色 和DAPI復染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光 顯微鏡 觀察，拍照。采用本發(fā)明的方法檢測表達GFP的細胞，其GFP 顏色 保持鮮亮， 信號 強度較培養(yǎng)狀態(tài)下無明顯改變，徹底解決了傳統(tǒng)固定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色明亮，易于檢測和后續(xù)多重標記，且避免了甲酰胺變性、 鹽酸 酸化 等方法步驟繁瑣的缺點。，下面是一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法專利的具體信息內(nèi)容。

1.一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法，其特征在于：對以綠色熒光蛋白作為報告蛋白的細胞進行BrdU標記檢測和DAPI復染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照；具體步驟如下：
1)向表達GFP的細胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30μg/ml，37℃培養(yǎng)條件下?lián)饺?.5～3h；
2)以Hank’s液配制0.1％甲醛，培養(yǎng)條件下固定細胞10～12h；
3)Hank’s液沖洗3次，每次5min；
4)0.2％Triton X-100作用20min；
5)Hank’s液沖洗3次，每次5min；
6)100U/ml DNase I，室溫處理5min；
7)TBS沖洗3次，每次5min；
8)室溫封閉液封閉1h；
9)加入抗BrdU一抗，4℃濕盒中孵育過夜；
10)TBS沖洗3次，每次5min；
11)加入二抗，37℃孵育30min；
12)TBS沖洗3次，每次5min；
13)加入DAPI，室溫2min；
14)TBS沖洗3次，每次5min；
15)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法，其特征在于：所述培養(yǎng)條件是指5％CO2、飽和濕度、溫度37℃。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法，其特征在于：所述Hank’s液的pH在7.2～7.4，其中各物質的濃度為：5.4mmol/L KCl，0.3mmol/LNa2HPO4，
0.4mmol/L KH2PO4，4.2mmol/L NaHCO3，1.3mmol/L CaCl2，0.5mmol/L MgCl2，0.6mmol/LMgSO4，137mmol/L NaCl，5.6mmol/L D-葡萄糖。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法，其特征在于：所述TBS的pH為7.6，其中各物質的濃度為：150mmol/L NaCl，20mmol/L Tris.Cl。

說明書全文

一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法

技術領域

[0001] 本發(fā)明涉及一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法。
[0002] 背景技術
[0003] 綠色熒光蛋白(GFP)是從水母體內(nèi)分離獲得的一種發(fā)光蛋白，吸收藍光，發(fā)綠光，且不需光發(fā)射輔因子。由于GFP在哺乳動物細胞穩(wěn)定、熒光顯微鏡又容易檢測，因此GFP已是常用的標記分子，是目前分子生物學家和細胞生物學家用于目的蛋白示蹤和定量的最有用的研究工具。但對表達GFP的細胞進行常規(guī)固定(常用的固定液有：70％乙醇、4％多聚甲醛、丙酮、甲醇等)、核酸變性(甲酰胺、鹽酸)、多重染色后，GFP信號明顯減弱，甚至無法檢測。圖像結果往往需要進行后期處理。
[0004] BrdU是用于標記增殖分裂的細胞，屬于DNA結合型熒光染料，其基本原理是利用溴化脫氧尿嘧啶(BrdU)作為胸苷類似物可以摻入到新增殖細胞合成DNA中。BrdU會隨著細胞分裂而不斷被“稀釋”，以至于最終完全不能檢出，因而不適合做長時期的體內(nèi)標記追蹤。其主要優(yōu)點是抗BrdU抗體與BrdU反應后顯色可即刻顯現(xiàn)標記的情況，其缺點細胞分裂時標記強度降低或標記丟失，增殖的細胞逐漸降低細胞BrdU標記。因此，BrdU適用于短期標記增殖的細胞。
[0005] DAPI，4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride(DAPI)，中文名稱是4’，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，是一種常用的顯現(xiàn)活細胞或固定細胞DNA的熒光染料，其作用機理與溴化乙錠等染色劑的機理類似：它們與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結合。沒結合DNA的DAPI熒光很弱，而一旦和DNA結合，表現(xiàn)出很強的熒光。并且對細胞相對無毒，不改變細胞的超微結構。結合后產(chǎn)生的熒光基團的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV(紫外光)的激發(fā)波長正好是356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。DAPI最大的優(yōu)點就是標記技術簡單，而標記效率很高(起初達
100％)，標記的細胞能清楚的觀察到；缺點是細胞分裂將導致DAPI淬滅，以及收縮蛋白或其它蛋白染色所造成的強背景色等將引起標記強度降低。因此DAPI也僅適于短期定量分析。
[0006] 發(fā)明內(nèi)容
[0007] 本發(fā)明的目的是：改進以往的細胞固定、核酸變性方法及處理時間，從而達到各染色結果互不干擾，GFP顏色明亮易檢的目的。
[0008] 針對上述目的，本發(fā)明提供了一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法，解決了傳統(tǒng)固 定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色明亮，易于檢測；且避免了甲酰胺、鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0010] 一種改進的GFP表達細胞的增殖檢測方法：對以綠色熒光蛋白(GFP)作為報告蛋白的細胞進行BrdU摻入染色和DAPI復染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
[0011] 具體使用時，可以采用以下步驟：
[0012] 1)向表達GFP的細胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30μg/ml，37℃培養(yǎng)條件下標記0.5～3h(視細胞增殖能力而定)；
[0013] 2)以Hank’s液配制0.1％甲醛(體積濃度)，培養(yǎng)條件下固定細胞10～12h； [0014] 3)Hank’s液沖洗3次，每次5min；
[0015] 4)0.2％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min；
[0016] 5)用Hank’s液沖洗3次，每次5min；
[0017] 6)100U/ml DNase I(脫氧核糖核酸酶I)，室溫處理5min；
[0018] 7)TBS沖洗3次，每次5min；
[0019] 8)室溫封閉液封閉1h；
[0020] 9)加入抗BrdU一抗，4℃濕盒中過夜；
[0021] 10)TBS沖洗3次，每次5min；
[0022] 11)加入二抗，37℃孵育30min；
[0023] 12)TBS沖洗3次，每次5min；
[0024] 13)加入DAPI，室溫2min；
[0025] 14)TBS沖洗3次，每次5min；
[0026] 15)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
[0027] 所述培養(yǎng)條件是指5％CO2、飽和濕度、溫度37℃。
[0028] 所述Hank’s液的pH在7.2～7.4，其中各物質的濃度為：5.4mmol/L KCl，0.3mmol/LNa2HPO4，0.4mmol/L KH2PO4，4.2mmol/L NaHCO3，1.3mmol/L CaCl2，0.5mmol/L MgCl2，0.6mmol/L MgSO4，137mmol/LNaCl，5.6mmol/L D-葡萄糖。
[0029] 所述TBS的pH為7.6，其中各物質的濃度為：150mmol/LNaCl，20mmol/LTris.Cl。 [0030] 所述封閉液為正常血清，為本領域中所常用，可以視二抗來源確定。 [0031] 采用本發(fā)明的方法檢測表達GFP的細胞，其GFP顏色保持鮮亮，信號強度較培養(yǎng)狀態(tài)下無明顯改變，徹底解決了傳統(tǒng)固定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色 明亮，易于檢測和后續(xù)多重標記，且避免了甲酰胺變性、鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點。 [0032] 本發(fā)明方法適用于多種細胞，并可在此基礎上進行多種后續(xù)標記。結果可分析以GFP為報告蛋白的目的基因的轉染率以及目的基因對細胞增殖的影響及相關抗原檢測。 [0033] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，操作簡單，避免了常規(guī)固定方法和甲酰胺變性、鹽酸酸化等對GFP的影響，可以更好的保持GFP的熒光信號。本發(fā)明將BrdU摻入染色、DAPI復染與GFP表達細胞相結合，GFP信號仍能保持到與培養(yǎng)條件相當強度，取得了意想不到的效果，有創(chuàng)造性。
[0034] 附圖說明
[0035] 圖1為轉染腺病毒細胞培養(yǎng)條件下表達GFP；
[0036] 圖2為常規(guī)固定、染色后所得GFP圖片與本發(fā)明的方法所得GFP亮度圖片的比較：B為常規(guī)固定、染色后所得GFP圖片，C為本發(fā)明的方法所得GFP亮度圖片。 [0037] 具體實施方式
[0038] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明：
[0039] 實施例：對GFP表達細胞進行增殖檢測，步驟如下：
[0040] 1)向表達GFP的細胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30μg/ml，37℃培養(yǎng)條件下?lián)饺?h； [0041] 2)以Hank’s液配制0.1％甲醛(體積濃度)，培養(yǎng)條件下固定細胞12h； [0042] 3)Hank’s液沖洗3次，每次5min；
[0043] 4)0.2％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min；
[0044] 5)用Hank’s液沖洗3次，每次5min；
[0045] 6)100U/ml DNase I(脫氧核糖核酸酶I)，室溫處理5min；
[0046] 7)TBS沖洗3次，每次5min；
[0047] 8)正常山羊血清室溫封閉1h；
[0048] 9)加入抗BrdU一抗，4℃濕盒中過夜；
[0049] 10)TBS沖洗3次，每次5min；
[0050] 11)加入羊抗小鼠二抗(羅丹明標記)，37℃孵育30min；
[0051] 12)TBS沖洗3次，每次5min；
[0052] 13)加入DAPI，室溫2min；
[0053] 14)TBS沖洗3次，每次5min；
[0054] 15)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
[0055] 所述培養(yǎng)條件是指5％CO2、飽和濕度、溫度37℃。
[0056] 所述Hank’s液的pH在7.2～7.4，其中各物質的濃度如下：5.4mmol/L KCl，0.3mmol/LNa2HPO4，0.4mmol/L KH2PO4，4.2mmol/L NaHCO3，1.3mmol/L CaCl2，0.5mmol/L MgCl2，0.6mmol/L MgSO4，137mmol/LNaCl，5.6mmol/L D-葡萄糖。
[0057] 所述TBS的pH為7.6，其中各物質的濃度為：150mmol/LNaCl，20mmol/LTris.Cl。 [0058] 本實施例中表達GFP的細胞為攜帶GFP的兔血管外膜成纖維細胞。 [0059] 顯微鏡觀察結果如圖1所示，由圖可見，進行BrdU、DAPI標記后，GFP顏色保持鮮亮，信號強度較培養(yǎng)狀態(tài)下無明顯改變。
[0060] 另外對GFP表達細胞進行常規(guī)固定、染色、封片、顯微鏡觀察，得到GFP圖片作為對照，與經(jīng)本發(fā)明的方法處理后得到的GFP圖片對比(如圖2所示)。由圖可見，經(jīng)本發(fā)明的方法處理后得到的GFP圖片中GFP顏色鮮亮，信號強度強，圖像結果無需進行后期處理，且各染色結果互不干擾。
[0061] 本發(fā)明與常規(guī)方法相比，其不同點如表1所示：
[0062] 表1
[0063]
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